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近日，中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心王凱研究組在《自然-方法》（Nature Methods）上，在線發(fā)表了題為Volumetric Voltage Imaging of Neuronal Populations in Mouse Brain by Confocal Light Field Microscope的研究論文。該研究開發(fā)了新型三維光場顯微成像技術，提升了神經元電壓光學成像的通量。這一技術能夠對小鼠腦三維神經網(wǎng)絡中數(shù)百神經元的膜電位進行高速同步記錄，為解析神經網(wǎng)絡的信息處理機制提供了新工具。光場成像需要高靈敏度、大靶面的相機來同時記錄多個視角的投影圖像。而由于相機的數(shù)據(jù)帶寬受限，大靶面相機的幀率無法滿足電壓成像的速度需求。該團隊提出通過降低采集圖像的動態(tài)范圍來換取更高的幀率。通常情況下電壓成像需要較高的動態(tài)范圍來捕捉高基線上微弱變化的信號，但該團隊采用廣義共聚焦原理，高選擇性濾除背景來降低信號基線，并整合多個視角的信息，實現(xiàn)了利用低動態(tài)范圍的相機來高效捕捉微弱的電壓信號。進一步，為了最大限度降低系統(tǒng)的噪聲，該團隊探討了光場成像中的噪聲來源，發(fā)現(xiàn)了激光光源的強度噪聲、掃描振鏡的同步噪聲以及動物血液流動導致的激光散斑噪聲均能夠降低電壓成像的信噪比。同時，該研究提出了基于單振鏡雙面掃描的共聚焦光場成像技術。這一技術結合高數(shù)值孔徑的光照明策略和新數(shù)據(jù)處理方法，將系統(tǒng)噪聲降低至泊松噪聲理論極限。為了最大化熒光信號的捕獲效率，實現(xiàn)長時程持續(xù)電壓成像，該研究優(yōu)化了系統(tǒng)的光學效率。研究顯示，通過自主設計定制密集排列的微透鏡陣列并最小化光學元件的數(shù)量，系統(tǒng)的通光效率比前期工作提高約3倍。該團隊將這些成果整合在新型共聚焦光場顯微鏡中，實現(xiàn)了對清醒小鼠腦三維視場中數(shù)百個神經元的電壓信號的同步記錄，并以每秒400幀的速度連續(xù)成像超過20分鐘。新型共聚焦光場顯微鏡彌補了電壓成像在成像通量、信噪比與成像時長上的不足，提升了電壓成像的應用范圍。為了驗證電壓成像獲取的信號真實可靠，該團隊記錄了清醒小鼠初級視皮層中數(shù)百個神經元對光柵視覺刺激的反應特性。通過對神經元動作電位發(fā)放情況的統(tǒng)計，電壓成像鑒別出具有不同方向選擇性的神經元，而這些具有調諧特征的神經元占比與該區(qū)域已知的神經元特性相符。進而，該團隊對數(shù)百個神經元構成的三維神經網(wǎng)絡進行了功能連接分析。研究發(fā)現(xiàn)，與膜片鉗記錄相比，電壓成像可在清醒動物中開展，且通量提高約100倍。分析表明，神經元之間同時存在興奮性和抑制性功能連接，在短距離內抑制性連接強于興奮性連接。這種興奮-抑制的連接差異在三維空間上近似垂直于皮層表面的圓柱體。該團隊研發(fā)了新型三維電壓成像新技術，提高了電壓成像的通量，使在清醒動物中進行三維神經網(wǎng)絡的功能聯(lián)接分析成為可能。這一技術為電壓成像技術的應用奠定了基礎，并為神經科學研究提供了新工具。研究工作得到科學技術部、國家自然科學基金委員會、中國科學院及中國博士后科學基金的支持。三維光場電壓成像顯微鏡示意圖和小鼠腦三維神經網(wǎng)絡電壓成像示例圖