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過氧化氫酶是普遍存在于自然界的血紅素鐵酶。過氧化氫酶活性主要是分解H₂O₂，產(chǎn)生H₂O和O₂，以保護(hù)生物體不被過氧化氫毒害。當(dāng)前，過氧化氫酶的主要研究方向?yàn)?/span>H₂O₂的分解機(jī)制及其生理功能研究，但過氧化氫酶的O₂的代謝利用機(jī)制未見報道。有研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶EasC利用O₂催化麥角生物堿核心骨架四并環(huán)結(jié)構(gòu)中C環(huán)合成時不需要額外添加NADPH等還原劑，推測其可能代表未知的氧氣激活與氧同化機(jī)制。

近日，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所高書山團(tuán)隊(duì)與杭州師范大學(xué)郭瑞庭團(tuán)隊(duì)合作，破解了EasC蛋白底物復(fù)合體結(jié)構(gòu)，并利用波譜測定、體外生化、同位素標(biāo)記和化學(xué)計(jì)算等手段，在分子水平闡明了EasC利用O₂催化氧化環(huán)化反應(yīng)的新機(jī)制。

該團(tuán)隊(duì)通過電鏡獲得EasC酶與底物PCC的復(fù)合體結(jié)構(gòu)（2.33?），發(fā)現(xiàn)EasC呈現(xiàn)二聚體結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)PCC不是結(jié)合在heme口袋上方而是結(jié)合在過氧化氫酶共有的NADPH口袋。該位置距離heme口袋20.7?，兩口袋之間通過一個狹長ROS通道相連。進(jìn)一步，為探討EasC參與催化反應(yīng)的鐵氧復(fù)合物類型，研究檢測了酶的波譜特征。在有氧條件下，研究將底物PCC和EasC酶進(jìn)行快速混合，使用停留色譜檢測到416nm、544nm和590nm的最大吸收。該吸收區(qū)別于血紅素酶已報道的鐵-氧復(fù)合體Compound I的最大吸收，而與文獻(xiàn)報道的Compound III吸收一致，表明EasC中的血紅素鐵可能以Cpd III的方式參與催化反應(yīng)。電子順磁共振和紫外吸收測試顯示，在有氧條件下，靜息態(tài)EasC的Fe(III)接收底物電子并與O₂結(jié)合耦合，直接形成Cpd III。由于Cpd III可以分解生成超氧陰離子并回歸到靜息態(tài)Fe(III)，研究推測EasC催化過程或由超氧陰離子介導(dǎo)。因此，研究進(jìn)一步通過活性氧抑制實(shí)驗(yàn)、超氧陰離子恢復(fù)實(shí)驗(yàn)以及¹⁸O標(biāo)記的超氧陰離子自由基競爭性實(shí)驗(yàn)，鑒定出氧氣被活化成超氧陰離子的活性氧形式、參與底物的轉(zhuǎn)化，而非傳統(tǒng)的鐵-氧復(fù)合物轉(zhuǎn)化底物。

基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該團(tuán)隊(duì)提出了基于活性氧超氧陰離子的反應(yīng)機(jī)制。結(jié)合在NADPH口袋的底物PCC，其吲哚氨基將一個電子傳遞給血紅素口袋的Fe(III)，后者同時和氧氣結(jié)合形成Fe(III)-O₂?^- (Cpd III)；Cpd III進(jìn)一步分解成Fe(III)和超氧陰離子，生成的超氧陰離子通過兩個口袋之間的ROS通道進(jìn)入NADPH口袋；超氧陰離子與底物PCC結(jié)合，催化復(fù)雜的氧化環(huán)化反應(yīng)，完成麥角生物堿C環(huán)的合成。

這一研究闡釋了麥角生物堿核心骨架C環(huán)的生物合成機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了過氧化氫酶EasC利用超氧陰離子以實(shí)現(xiàn)氧氣激活并進(jìn)一步催化氧化環(huán)化反應(yīng)。該機(jī)制代表了全新的血紅素金屬酶的催化模式即氧氣無需形成活性鐵-氧復(fù)合物。同時，該成果使過氧化氫酶的相關(guān)研究從H₂O₂依賴性酶轉(zhuǎn)向O₂依賴性酶，拓展了過氧化氫酶這一生物催化劑的研究領(lǐng)域。

相關(guān)研究成果發(fā)表在《自然》（Nature）上。研究工作得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動專項(xiàng)等的支持。

論文鏈接

超氧陰離子催化麥角生物堿C環(huán)的合成機(jī)制

過氧化氫酶生成超氧陰離子催化藥物合成示意圖