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近日，中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心巫永睿團(tuán)隊(duì)與張余團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合上海師范大學(xué)王文琴團(tuán)隊(duì)，發(fā)現(xiàn)了植物質(zhì)體DNA（ptDNA）復(fù)制體中RNA引物切除的核心核酸酶組分plastid-localized and Mn2+-dependent 5′-3′exonuclease 1（PEN1）。長(zhǎng)期以來(lái)，植物ptDNA復(fù)制中負(fù)責(zé)RNA引物切除的核酸酶未被鑒定，而PEN1的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了領(lǐng)域的空缺，完善了ptDNA復(fù)制理論。DNA復(fù)制是生命科學(xué)的核心問(wèn)題之一。雙鏈DNA解旋后，引物酶在模板鏈上合成RNA引物。前導(dǎo)鏈僅需合成一個(gè)RNA引物即可由高持續(xù)合成能力的DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)連續(xù)延伸，滯后鏈需合成多個(gè)RNA引物，進(jìn)而通過(guò)不連續(xù)的岡崎片段合成方式完成復(fù)制。DNA復(fù)制后，RNA引物由核酸酶負(fù)責(zé)切除，從而保證基因組的完整性。在原核生物中，DNA聚合酶III是負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的酶，DNA聚合酶I是負(fù)責(zé)切除RNA引物的酶。DNA聚合酶I具有聚合酶活性及5′-3′外切酶活性。DNA聚合酶I在延伸DNA鏈時(shí)，同步利用其外切酶活性切除RNA引物。在內(nèi)共生過(guò)程中，光合藍(lán)細(xì)菌被非光合真核生物整合共生，進(jìn)而演變成質(zhì)體。質(zhì)體是半自主的細(xì)胞器，Pol1A和Pol1B負(fù)責(zé)ptDNA復(fù)制，但缺乏類(lèi)似于DNA聚合酶I的5′-3′外切酶結(jié)構(gòu)域。目前，負(fù)責(zé)ptDNA復(fù)制過(guò)程RNA引物切除的核酸酶尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，AtRNH1C可能參與RNA引物切除，而這一過(guò)程并非完全高效；AtRNH1C切割后，RNA-DNA連接處殘留1至3個(gè)核糖核苷酸，從而抑制DNA片段連接。因此，研究推測(cè)，需要其他尚未被鑒定的質(zhì)體定位的核酸酶來(lái)完全切除RNA引物并允許DNA片段連接，進(jìn)而確保ptDNA復(fù)制完成。該研究分離Pen1位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其編碼質(zhì)體特異定位的5′-3′外切酶。PEN1與ptDNA復(fù)制體的其他成分即Pol1A/1B和連接酶LIG1共定位于葉綠體擬核。研究顯示，PEN1能夠高效切割RNA引物切除過(guò)程中間體，并完全移除RNA-DNA連接處的核糖核苷酸，從而促進(jìn)LIG1連接。研究在體外重建了由PEN1、Pol1A/1B和LIG1介導(dǎo)的質(zhì)體RNA引物去除過(guò)程，證實(shí)PEN1參與ptDNA復(fù)制過(guò)程RNA引物移除。進(jìn)一步，該研究解析了PEN1-雙鏈DNA二元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。在PEN1的催化中心，被切割DNA鏈的第1個(gè)核苷酸的5'單磷酸基團(tuán)與活性中心的Mg2+形成配位鍵，且連接第2和第3個(gè)核苷酸的磷酸二酯鍵的同時(shí)與K250、R264、R283形成3個(gè)鹽橋，使被切割DNA鏈在活性中心的相對(duì)位置被固定，進(jìn)而使PEN1精確切割第1個(gè)和第2個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，發(fā)揮核酸外切酶活性。為探討Pen1突變對(duì)ptDNA的影響，研究分離ptDNA和Detail-Seq發(fā)現(xiàn)，Pen1功能缺失導(dǎo)致ptDNA斷裂，且斷點(diǎn)主要積累在ptDNA正義鏈上。同時(shí)，研究顯示，Pen1功能缺失抑制ptDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活性，從而影響質(zhì)體的正常發(fā)育和功能。上述研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)體特異性的5′-3′外切酶PEN1能夠直接催化質(zhì)體DNA復(fù)制過(guò)程中RNA引物移除，并闡明了其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。這為質(zhì)體復(fù)制尤其是RNA引物移除過(guò)程提供了進(jìn)一步的理解，有望推動(dòng)作物改良的質(zhì)體遺傳工程進(jìn)展。6月25日，相關(guān)研究成果發(fā)表在《自然-植物》（Nature Plants）上。研究工作得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專(zhuān)項(xiàng)（B類(lèi)）等的支持。論文鏈接PEN1介導(dǎo)ptDNA復(fù)制RNA引物的移除