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中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心周斌研究組與香港中文大學呂愛蘭研究組合作，構(gòu)建了雙同源重組酶系統(tǒng)，建立了體內(nèi)神經(jīng)中胚層祖細胞（NMPs）的譜系示蹤與功能研究技術(shù)，并結(jié)合單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，揭示了NMPs在胚胎發(fā)育中的細胞命運和分子特征。這一研究揭示了NMPs在胚胎發(fā)育中的分布、分化潛能和功能，為脊髓損傷的細胞治療提供了新的研究方向。脊髓作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，承擔著神經(jīng)信號傳導和肌肉運動協(xié)調(diào)等關(guān)鍵功能。目前，針對脊索退行性病變和外源性脊髓損傷的治療手段存在局限性。體外細胞實驗表明，NMPs能夠分化為脊髓中的神經(jīng)細胞，并可以產(chǎn)生周圍的中胚層組織，在脊髓損傷的細胞治療中具有應用前景。盡管既往研究證實NMPs具有雙向分化潛能，但缺乏在體內(nèi)直接示蹤和功能評估的遺傳工具。因此，開發(fā)精準靶向體內(nèi)NMPs的技術(shù)對揭示其細胞命運和功能至關(guān)重要。該研究設計和構(gòu)建了多種雙同源重組酶系統(tǒng)，建立了哺乳動物體內(nèi)特異性標記NMPs的遺傳譜系示蹤新技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，NMPs具有雙向分化潛能，能夠同時生成神經(jīng)細胞和中胚層細胞。同時，研究通過特異性清除NMPs實驗，發(fā)現(xiàn)NMPs減少導致胚胎軀干和尾部發(fā)育異常，證實了NMPs在胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵作用。研究對小鼠胚胎期8.5天的尾端組織進行單細胞測序。研究通過分析將細胞主要分為14個不同的簇，如NMPs、Neural tube、Somite和Presomitic mesoderm等。進一步，分析發(fā)現(xiàn)，NMPs特異性表達Brachyury（T）和Sox2，并高表達Nkx1-2、Epha5、Fgf17和Fgf8等分子標志基因。研究還揭示NMPs的分化受到Wnt、FGF和BMP等信號通路的調(diào)控：Wnt和FGF信號通路促進NMPs向中胚層分化，而BMP信號通路則通過抑制Sox2的表達推動NMPs向中胚層命運轉(zhuǎn)變；相反地，視黃酸信號通路通過抑制Wnt信號促進NMPs向神經(jīng)命運分化。為精準示蹤NMPs，研究利用Dre-rox和Cre-loxP兩套同源重組系統(tǒng)，分別構(gòu)建T-DreER和Sox2-CreER基因敲入遺傳工具小鼠，來分別標記T來源和Sox2來源的細胞。研究設計了兩套遺傳策略來特異性標記示蹤體內(nèi)NMPs。在第一套策略中，研究使用Rosa26-traffic light reporter系統(tǒng)。研究顯示，通過Tamoxifen誘導，可在T-DreER、Sox2-CreER、R26-TLR小鼠體內(nèi)同時分別標記T+細胞、Sox2+細胞和T+Sox2+雙陽性細胞。這一方法實現(xiàn)了在單個胚胎中同時追蹤T+、Sox2+和T+Sox2+三群細胞。為更清晰直觀地標記NMPs，探究NMPs的細胞定位、細胞運動和分化的細胞類型，研究開發(fā)設計了第二套策略即R26-RL-GFP系統(tǒng)。在T-DreER、Sox2-CreER、R26-RL-GFP三基因小鼠中，只有Dre-rox和Cre-loxP雙重重組的情況下才可以激活GFP表達，從而特異性地標記T+Sox2+的NMPs。通過這兩套雙重組酶介導的遺傳標記系統(tǒng)，研究追蹤了NMPs在胚胎發(fā)育過程中的時空分布，發(fā)現(xiàn)了這些細胞主要定位于胚胎的尾部區(qū)域并參與神經(jīng)管、軸旁中胚層和部分內(nèi)胚層組織的形成。為探討單個NMP是否具有雙向分化潛能，研究利用R26-confetti2報告系統(tǒng)進行單細胞克隆分析。通過低劑量Tamoxifen誘導，研究在E8.5標記了單個NMP。進一步，結(jié)果顯示，單個NMP能夠分化為神經(jīng)細胞克隆、中胚層細胞克隆或同時生成兩種細胞類型的混合克隆，這證實了NMPs在體內(nèi)的雙向分化潛能。研究還發(fā)現(xiàn)，少數(shù)NMPs能夠分化為內(nèi)胚層細胞，這擴展了NMPs在胚胎發(fā)育中的已知貢獻，揭示了其在多胚層組織形成中的潛在作用。進一步，為闡明NMPs在胚胎發(fā)育中的功能，研究開發(fā)了T-DreER、Sox2-CreER、R26-LR-DTR小鼠模型，通過雙重組酶介導白喉毒素受體的表達，特異性清除NMPs。實驗結(jié)果顯示，NMPs清除導致胚胎軀干和尾部發(fā)育異常，表現(xiàn)為尾部縮短和軀干結(jié)構(gòu)畸形，這證明了NMPs在胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵作用。研究還發(fā)現(xiàn)，NMPs的清除時間點對其功能影響顯著。E8.5清除NMPs僅導致輕微的尾部發(fā)育缺陷，而E10.5清除則引發(fā)嚴重的軀干和尾部發(fā)育異常，這或與胚胎發(fā)育過程中其他細胞群體的代償作用有關(guān)。上述研究通過開發(fā)新型遺傳工具，在體內(nèi)實現(xiàn)了對NMPs的特異性遺傳標記、示蹤和功能評估。這一研究深化了科研人員對NMPs在胚胎發(fā)育中作用機制的認知，為疾病建模、藥物研發(fā)與細胞治療等的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。4月3日，相關(guān)研究成果以Dual genetic tracing demonstrates the heterogeneous differentiation and function of neuromesodermal progenitors?in vivo為題，在線發(fā)表在《美國國家科學院院刊》（PNAS）上。研究工作得到國家自然科學基金委員會、科學技術(shù)部、中國科學院、上海市科學技術(shù)委員會、香港研究資助局等的支持。論文鏈接示蹤的NMPs在胚胎E8.5和E10.5的時空分布