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基因組編輯技術(shù)作為生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要突破，為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)提供了技術(shù)支撐。以CRISPR及其衍生技術(shù)為代表的編輯系統(tǒng)通過可編程的向?qū)NA引導(dǎo)Cas9等核酸酶靶向基因組特定位點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于特定堿基和短片段DNA的精準(zhǔn)編輯。但是，大片段DNA編輯至今仍面臨挑戰(zhàn)，對(duì)數(shù)千乃至數(shù)百萬堿基的精準(zhǔn)操縱更是領(lǐng)域的核心難題。突破該技術(shù)壁壘，將為實(shí)現(xiàn)大尺度基因組操縱提供關(guān)鍵支撐——包括基因關(guān)鍵區(qū)域的替換與修復(fù)、功能基因序列的完整插入、基因簇的刪減或重定位以及人工構(gòu)建基因組結(jié)構(gòu)變異等。這不僅可以推動(dòng)遺傳操縱技術(shù)革新，更將成為疾病治療與作物改良技術(shù)瓶頸的突破口。理想的大片段DNA編輯工具可以同時(shí)支持染色體水平的多種編輯類型，包括精準(zhǔn)插入、替換、刪除、倒位與易位等。然而，現(xiàn)有工具在編輯效率、尺度、精準(zhǔn)性及類型多樣性等方面存在不足。

近日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團(tuán)隊(duì)報(bào)道了新型可編程的染色體水平大片段DNA精準(zhǔn)操縱技術(shù)PCE。這一技術(shù)在動(dòng)植物中實(shí)現(xiàn)了從千堿基到兆堿基級(jí)別DNA的多種類型且精準(zhǔn)無痕的編輯，提升了真核生物基因組的操縱尺度和能力。

位點(diǎn)特異性重組酶Cre-Lox系統(tǒng)具有染色體水平DNA操縱潛力，但其應(yīng)用受到三個(gè)關(guān)鍵問題制約：Lox位點(diǎn)固有的對(duì)稱性導(dǎo)致重組反應(yīng)可逆，不利于目的編輯發(fā)生；Cre酶作為四聚體工作，提升其活性的工程改造難度高；重組后特異性位點(diǎn)殘留，影響編輯的精準(zhǔn)性。為突破上述限制，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了系統(tǒng)性技術(shù)路徑，實(shí)現(xiàn)三項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新。團(tuán)隊(duì)開發(fā)出高通量重組位點(diǎn)快速改造平臺(tái)，并提出不對(duì)稱Lox位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，創(chuàng)制新型Lox變體，其可逆性重組活性降低至接近陰性對(duì)照水平，同時(shí)保持其原有的高效正向重組能力。進(jìn)一步，基于團(tuán)隊(duì)此前自主開發(fā)的融合蛋白通用逆折疊模型、結(jié)構(gòu)與進(jìn)化約束信息的蛋白定向進(jìn)化平臺(tái)AiCE，實(shí)現(xiàn)對(duì)Cre蛋白多聚化界面的精準(zhǔn)優(yōu)化，獲得重組效率提升至3.5倍的工程化Cre蛋白變體。團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建并優(yōu)化了重組酶的無痕編輯策略Re-pegRNA，利用引導(dǎo)編輯器的高效編輯特性，通過設(shè)計(jì)特異性pegRNA對(duì)重組后殘留的Lox位點(diǎn)進(jìn)行“重引導(dǎo)編輯”，將其精準(zhǔn)替換為原有基因組序列。

通過上述三項(xiàng)技術(shù)的集成優(yōu)化，科研團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了PCE與RePCE兩個(gè)可編程染色體編輯系統(tǒng)，可對(duì)不同Lox位點(diǎn)的插入位置和方向進(jìn)行靈活編程，實(shí)現(xiàn)從kb到Mb尺度的大片段DNA精準(zhǔn)無痕操縱。在動(dòng)植物細(xì)胞中，研究人員利用這一系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了18.8 kb超大片段DNA的定點(diǎn)整合、5 kb序列的定向替換、12 Mb的染色體倒位、4 Mb的染色體刪除及整條染色體的易位，并利用該技術(shù)創(chuàng)制了含315 kb精準(zhǔn)倒位的抗除草劑水稻種質(zhì)。

上述研究開發(fā)了新型染色體編輯系統(tǒng)PCE，在動(dòng)植物中實(shí)現(xiàn)了跨越kb到Mb級(jí)別的多類型染色體精準(zhǔn)操縱。這一工具不僅能夠?qū)崿F(xiàn)多基因疊加，而且可以通過操控基因組結(jié)構(gòu)變異，為作物性狀改良和遺傳疾病治療開辟新路徑。該技術(shù)有望推動(dòng)新型育種策略的發(fā)展，如通過操縱遺傳連鎖、調(diào)控重組頻率實(shí)現(xiàn)育性控制、消除連鎖累贅，釋放野生種質(zhì)資源中優(yōu)異等位基因的育種潛力。同時(shí)，精準(zhǔn)染色體編輯技術(shù)的突破將加速人工染色體構(gòu)建，在合成生物學(xué)等新興領(lǐng)域也頗有應(yīng)用前景。

8月4日，相關(guān)研究成果以Iterative recombinase technologies for efficient and precise genome engineering across kilobase to megabase scales為題，在線發(fā)表在《細(xì)胞》（Cell）上。研究工作得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部相關(guān)項(xiàng)目、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)等的支持。

論文鏈接

PCE系統(tǒng)的開發(fā)和精準(zhǔn)染色體編輯示意圖